jueves, 14 de marzo de 2013

1954 un investigador en España ya indicaba las importantes propiedades de las granadas






Contribución al estudio de la actividad antibacteriana del jugo de la porción carnosa de las semillas de Punica granatum L. por F. BUSTINZA.


La circunstancia de existir un granado en el Jardín Botánico enfrente de una de las ventanas del laboratorio donde trabajo, motivó el que hacia el final del otoño del 1954, se me ocurrió ensayar la actividad antibacteriana del jugo de la porción carnosa de las semillas de dicha planta. En placas con caldo agar sembradas con . diferentes bacterias observé que dicho jugo poseía gran actividad in vitro frente a todas las bacterias ensayadas y que fueron: Stakpylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus mycoides, Bacillus subtilis, Mycobacterium phlei, Mycobacterium sp (1), Sarcina lutea, Micrococcus lysodeikticus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus X 79, Pneumobacilo de Friedlánder, Vibrio comma, Shigella dysen- (Shiga) y Eberthella typhosa.






Desde luego dichas granadas procedentes de granado borde eran de sabor muy ácido y dosificada su acidez libre y expresada en ácido cítrico resultó ser de: 5,35 gramos en 100 c. c. (2). En vista de que en el Jardín Botánico no existían más granadas que éstas muy acidas procedentes de granados borde, me dirigí a mi (1) Recibida del N. C. T. C. como Mycobacterium phlei, pero según eí profesor Pensó esa estirpe no es Usada por el fago phlei. (2) El color del jugo de la granada,. debido a la punicina—-pigmento antociánico—.( glucósido de la pelargonidina), dificulta la determinación del pH con los papeles indicadores de pH. amigo el Dr. E. Gelabert, distinguido farmacéutico de Murcia, quien gentilmente me remitió varios lotes de granadas dulces, agridulces y agrias a fines de diciembre de 1954 y comienzos del 1955. Y en diciembre de 1955 el Sr. D. José Pico Ibarra, perito agrícola de Elche, por indicación del Dr. Gelabert, tuvo la amabilidad de recoger y enviarme granadas agrias. De todos los lotes de granadas recibidas, previa eliminación de las paredes "correspondientes al fruto, se separaron a mano con la mayor limpieza posible las semillas sanas y mediante presión suave en mortero limpio se obtuvo en cada caso el jugo correspondiente de la porción carnosa. La acidez del jugo procedente de las semillas de cada granada • fue dosificada diluyendo previamente el jugo con agua destilada hasta que apenas se percibiera la coloración antociánica y la valoración se hizo con sosa decinormal (3) empleando como indicador la disolución alcohólica de fenolftaleína y expresando la acidez en ácido cítrico.


La acidez expresada en cítrico de las granadas que me fueron remitidas en diferentes ocasiones por los Sres. Gelabert y Pico Ibarra osciló entre 0.159 g. en 100 c. c. de jugo y 1,57 g. en 100 c. c. en las granadas agrias y hasta 4,24 g. en 100 c. c. en las muy agrias. La acidez de las granadas de granado borde del Jardín Botánico y que en este trabajo llevarán las iniciales JB osciló entre 5,35 g. en 100 c. c. en mis primeras determinaciones y 4,94 g. en 100 c. c. en granadas recogidas más tarde. Todos los jugos de las granadas fueron ensayados y revelaron in vitro gran actividad frente al bacilo tífico y frente al Skiga (Bacilo disentérico) y ello independientemente de su concentración en ácido cítrico, pero su actividad frente al Estafilococo, Bacilo piociánico, Sarcina, Mycobacterium sp. etc. dependía de su concentración en ácido cítrico, por lo que el jugo de las granadas dulces no era activo frente a dichas bacterias. He ensayado también la actividad del jugo de granadas acidasv privado del pigmento antociánico por adsorción con carbón activo (3) El Dr. Fernando Montequi tuvo la gentileza de determinar el factor de !a disolución de sosa decinormal empleada en mis valoraciones. ANALES DEL I. BOTÁNICO A. J. CAVANILLES 7 y he observado que la actividad antibacteriana no había sido afectada. Claro está que en dicho jugo despigmentado existe cifra elevada de ácido cítrico responsable en gran parte de la actividad antibacteriana del jugo de granadas acidas, pero ese jugo despigmentado se reveló en todos los ensayos frente al bacilo tífico y al Shiga con mayor actividad que una disolución acuosa de ácido cítrico de igual concentración. Estimo de interés el aislamiento de la sustancia activa frente al bacilo tífico y al Shiga que se halla en todos los jugos de granada ensayados, tanto dulces, agridulces, como agrios, sin perder de vista que el ácido cítrico a determinada concentración también es activo frente a esas bacterias. Y esperando al otoño de 1956 para disponer de la nueva cosecha que nos permita proseguir estas investigaciones, daré a conocer algunos de mis ensayos preliminares, los cuales se reflejan en las fotografías que acompaño (4).




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He revisado la bibliografía a mi alcance y en la obra de Florey y colaboradores «Antibiotics» Vol. 1 pág. 595 en relación con la actividad antibacteriana de Punica granatum se indica que ejerce inhibición parcial frente al Staphylococcus aureus y que no inhibe a E. coli, pero no se especifica qué parte de la planta fue utilizada. O. A. Burshnell, M. Fukuda y I. Makinodan en su trabajo «Tke Antibacterial properties of some plants found iu Hawai» (Pacific Science Vol. IV, núm. 3, july 1950 págs. 167-183) en el cual analizan la actividad antibacteriana de más de un centenar de plantas, señalan que las semillas de Punica granatum poseen actividad frente a M. pyogenes y a Ps. aeruginosa pero no frente á E. coli y que todo el frutp (5) posee buena actividad frente al M. pyogenes, E. coli, Ps. aeruginosa, Salmonella typhosa, Salmonella montevideo, Salmonella Sckottmuelleri y Shigelta paradysenteriae.


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(4) Quiero dar las gracias a D. Juan Daza de Valdés por la preparación de los medios de cultivo empleados en estas experiencias. (5) Emplean la expresión whole fruit y me inclino a creer que se refieren ai jugo del fruto junto con el de las semillas, 8 ANALES DEL I. BOTÁNICO A. J. CAVANILLES Fotografía núm. i.—En caldo agar se han sembrado radialmente hasta el borde del pocillo central: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus V (estirpe resistente a la penicilina), Bacillus dysenteriae (Shiga) y Escherichia coli. El pocillo central se ha llenado con jugo de granada J. B. cuya acidez expresada en ácido cítrico era de 5)35 gramos en ioo c. c. Incubación a 37o y examen y fotografía de las placas a las 24 horas. Se aprecia inhibición bien patente de las 4 bacterias, especialmente Shiga y Coli. Fotografía núm. 2.—En el pocillo central se ha colocado el mis- . mo tipo de granada acida J. B. empleado en la experiencia de la fotografía núm. 1. Han sido inhibidas las cinco bacterias Gram negativas ensayadas: Eberthella typhosa, E. coli, Proteus X ig, Shiga y Vibrio comma. Fotografía núm. 3.—En el pocillo central se ha colocado jugo de granada cuya acidez expresada en cítrico era de 4,28 gramos en 100 c. c. Se aprecia inhbición bien clara de las bacterias ensayadas: E. typhosa, Shiga, E. coli, M. lysodeikticus y B. mycoides. Fotografía núm. 4.—En el pocillo central se ha colocado jugo de granada cuya acidez total expresada en cítrico era de 1,57 g. en 100 c. c.


Se aprecia inhibición bien patente de Shiga, Eb. typhosa y Mycobacterium sp. e inhibición algo menor de Staphylococcus aureus 313 y de Pseudomonas aeruginosa: Fotografía núm. 5.—Caldo agar sembrado con Eberthella typhosa. En el pocillo 1 se ha colocado jugo de granada J. B. (5,35 g. de cítrico en 100 c. c); en el pocillo 2, jugo de granada Alabares piñón de pasa (0.212 g. de cítrico en 100 c. a); en el pocillo 3, jugo de granada Agrihiedra (0.159 g. de cítrico en 100 ce.) y en el pocillo 4, jugo de granada Elche piñón tierno (0.212 g. de cítrico en 100 c. c). En el pocillo 5, se puso disolución de ácido cítrico al 1,5 % en agua destilada estéril. Observamos que la actividad de los 4 jugos de variedades diferentes de granada es muy grande y aproximadamente del mismo grado frente al bacilo tífico cuyo crecimiento está estimulado en el borde de la zona de inhibición. Los halos de inhibición alrededor de los pocilios 1, 2, 3 y 4 son 8 ANALES DEL I. BOTÁNICO A. J. CAVANILLES Fotografía núm. i.—En caldo agar se han sembrado radialmente hasta el borde del pocillo central: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus V (estirpe resistente a la penicilina), Bacillus dysenteriae (Shiga) y Escherichia coli. El pocillo central se ha llenado con jugo de granada J. B. cuya acidez expresada en ácido cítrico era de 5)35 gramos en ioo c. c. Incubación a 37o y examen y fotografía de las placas a las 24 horas. Se aprecia inhibición bien patente de las 4 bacterias, especialmente Shiga y Coli. Fotografía núm. 2.—En el pocillo central se ha colocado el mis- . mo tipo de granada acida J. B. empleado en la experiencia de la fotografía núm. 1. Han sido inhibidas las cinco bacterias Gram negativas ensayadas: Eberthella typhosa, E. coli, Proteus X ig, Shiga y Vibrio comma. Fotografía núm. 3.—En el pocillo central se ha colocado jugo de granada cuya acidez expresada en cítrico era de 4,28 gramos en 100 c. c. Se aprecia inhbición bien clara de las bacterias ensayadas: E. typhosa, Shiga, E. coli, M. lysodeikticus y B. mycoides. Fotografía núm. 4.—En el pocillo central se ha colocado jugo de granada cuya acidez total expresada en cítrico era de 1,57 g. en 100 c. c. Se aprecia inhibición bien patente de Shiga, Eb. typhosa y Mycobacterium sp. e inhibición algo menor de Staphylococcus aureus 313 y de Pseudomonas aeruginosa: Fotografía núm. 5.—Caldo agar sembrado con Eberthella typhosa. En el pocillo 1 se ha colocado jugo de granada J. B. (5,35 g. de cítrico en 100 c. c); en el pocillo 2, jugo de granada Alabares piñón de pasa (0.212 g. de cítrico en 100 c. a); en el pocillo 3, jugo de granada Agrihiedra (0.159 g. de cítrico en 100 ce.) y en el pocillo 4, jugo de granada Elche piñón tierno (0.212 g. de cítrico en 100 c. c). En el pocillo 5, se puso disolución de ácido cítrico al 1,5 % en agua destilada estéril.






Observamos que la actividad de los 4 jugos de variedades diferentes de granada es muy grande y aproximadamente del mismo grado frente al bacilo tífico cuyo crecimiento está estimulado en el borde de la zona de inhibición. Los halos de inhibición alrededor de los pocilios 1, 2, 3 y 4 son 10 ANALES DEL I. BOTÁNICO A. J. CAVANILLES carbón activo. El jugo una vez filtrado era perfectamente incoloro y su acidez había bajado a 4,04 g. de cítrico en 100 c. c. Como resultado de esta experiencia se llega a la conclusión de que el antociano no es responsable de la actividad antibacteriana del jugo de la granada ya que el jugo desprovisto de dicho pigmento revela igual actividad. Fotografía núm. 10.—Caldo agar sembrado con Eberthella typhosa. En el pocillo 1 se ha puesto jugo de granada (acidez en cítrico 4,94 g. en 100 c. c. y en el pocillo 2, ese mismo jugo desprovisto de su pigmento por adsorción sobre carbón activo (6) y cuya acidez era de 4,04 g. de cítrico en 100 c. c. En el pocillo 3, se puso suspensión en agua estéril del carbón activo que había fijado el pigmento y cierta cantidad de cítrico, y en el pocillo 4, se puso de disolución de ácido cítrico en agua destilada a la concentración de 5,4 °/0. El resultado de esta experiencia confirma el resultado del grupo de experiencias de las fotos 8 y 9, o sea que el pigmento adsorbido por el carbón activo, no es responsable de la actividad y que una disolución acuosa de ácido cítrico de concentración incluso superior a la concentración de dicho ácido en el jugo de granadas muy acidas produce en las condiciones en que se realizó la experiencia una inhibición frente al Bacilo tífico inferior a la del jugo de esas granadas con pigmento o sin él. Fotografía núm. 11.—Caldo agár sembrado con Staphylococcus aureus H. En el pocillo 1, se puso jugo de granada cuya acidez expresada en cítrico era de 4,25 g. en 100 c. c. En el pocillo 2, jugo de granada con 1,57 g. de cítrico en 100 c. c; en el pocillo 3, jugo de granada con 0.25 g. de cítrico en 100 c. c. y en el pocillo 4, se puso jugo de limón cuya acidez total expresada en cítrico era de 6,20 g. en 100 c. c. Observemos que el halo de inhibición es proporcional a la concentración en ácido cítrico en los jugos ensayados y que el jugo que contiene solamente 0,25 g. de ácido cítrico en 100 c. c. no produce inhibición apreciable. (6) Farnell's Grada 14 Charcoal, ANALES DEL I. BOTÁNICO A. J. CAVANILLES II Obsérvese el estímulo del crecimiento del estafilococo alrededor del pocillo 3 y en los pocilios 2 y i en la zona exterior próxima a la de inhibición. Fotografía núm. 12.—Caldo agar sembrado con Mycobacterium sp. En los pocilios se han colocado los mismos líquidos que en los pocilios de la experiencia correspondiente a la fotografía 11. Observamos que el jugo de granada con ácido cítrico a la concentración de 0,25 °/o, no inhibe al Mycobacterium sp. y que en los otros pocilios la inhibición es proporcional al ácido cítrico contenido en los jugos. Experiencias similares realizadas con Bacilo piociánico y con Sarcina lutea revelaron idénticos resultados. De modo que frente a ciertas bacterias como Staphylococcus aureus, Mycobacterium sp., B. piociánico y Sarcina la actividad de los, jugos de granada es proporcional a su contenido en ácido cítrico y si •las granadas son dulces, con acidez cítrica inferior a 0.25 g. en 100 c. c , no revelan actividad in vitro frente a esas bacterias, aunque si muestran actividad frente al bacilo tífico y al Shiga.




CONCLUSIONES

El jugo de la porción carnosa de las semillas de granadas dulces es activo in vitro frente a Eberthella typkosa y Skigella dysenteriae. El jugo de la porción carnosa de las semillas de granadas agrias y de las granadas muy acidas es activo in vitro frente a bacterias Gram positivas y Gram negativas tales como: Staphylococcus aureus, Sarcina lutea, Bacillus mycoides, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Micrococcus lysodeikticus, Mycobacterium sp., Pneumobacilo de Friedlander, Vibrio comma, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Prdteus X rg, Eberthella typkosa y Skigella dysenteriae. Dicha actividad es én general tanto mayor cuanto mayor es la acidez del jugo, pero frente a Eberthella typkosa y Shigella dysenteriae la actividad de esos jugos es mayor que la actividad de disoluciones acuosas de ácido cítrico en concentración equivalente a la acidez de los jugos expresada en cítrico. Tanto en las granadas dulces como en las acidas existe una o mas sustancias —no identificadas aún— con actividad frente a Eberthella typhosa y Shigella disenteria*.

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